RESULTADOS OBTIDOS

B)    Processo de Cristalização na Biorremediação

            Após a quantificação percentual de cada produto que compõe a mistura microbiológica equivalente à Patente de Inovação UFBA 2010, estes foram homogeneizados e colocados em placas de Petri fechadas. Estes procedimentos foram feitos por etapa, inicialmente a fim de serem repicadas as semeaduras nos aquários de experimental, protótipo de campo para biorremediação. Em segundo para serem observadas as reações bioquímicas,  entre microorganismos (fungos) e as substancias organicas e inorganicas presente na mistura de hidrocarbonetos, sedimento e recina de mamona, além da presença da solução salina  os quais são determinados pelo tempo e volatilização para o processo de cristalização protéica.

                        Fig. Mistura Microbiológica após 90 dias em processo de cristalização

1.      2. 1 Caracterização dos Cristais Protéicos

Sabe-se que o cristal Halita (NaCl) também é o responsável pelos compostos com ligação iônica. Para investigação dos possíveis elementos inorgânicos que estão contribuindo na biorremediação foi analisado de Fluorescência de Raios-X, e Difratometria de Raios-X. Para tal análise, selecionou-se os cristais em aparelho de Lupa Eletrônica, foram macerados e condicionados, obtendo-se o 7º resultado de XRF e 8º resultado, Difratometria de Raios-X.  Para comprovação foi realizada a semeadura 2 para comparação com o fator tempo, o antes e depois de 90 dias e analisado por Difratometria de Raio-X. Outra metodologia empregada foi para analisar o residual de produto microbiológico cristalizado em infravermelho. Fez-se pastilhas de boro, obtendo-se a origem orgânica do produto.

2. 2. 2 Formação de película, biopolímero durante a biorremediação

Percebeu-se que, com 4 dias, a simulação com o fungo Aspergillus spp e o bioestímulo torta de mamona gerou, em cima da água, uma camada de emulsão oleosa, redução e mobilidade, que passou a ficar escura e turva. Com 15 dias, a solução apresentava-se muito escura, com fermentação de fungos e emulsão na superfície. Já com 34 dias, as substâncias que estavam emulsificadas formaram uma película biopolímeros, enquanto que a solução salina tornou-se de cor clara, sem espuma e com resíduo de sedimento no fundo. Provavelmente o biopolímero foi sintetizado pelo processo de transformação bioquímica e microbiológica dos fungos, para o seu metabolismo e assimilação. Este processo de polimerização residual foi analisado em infravermelho (Capítulo 4). Pode-se então fazer uma comparação entre os dois resultados de infravermelho, do biopolímero e do cristal protéico.

A composição inorgânica da membrana biopolímero foi investigada com base nos dados dos de XRF, comparando a produção dos fungos Aspergillus spp, seco e gelatinoso com amostras dos Penicillium spp , gelatinoso.

                     Fig. Foto Microscopia Eletrônica de Varredura 0.05 mm de Biopolímero

2.  2. 3 Análise Microbiológica e caracterização dos fungos durante o período de biorremediação

            As amostras colhidas no experimental do laboratório de campo foram enviadas ao Laboratório de Toxicologia de Farmácia da UFBA analisadas, com o objetivo de acompanhar, isolar e identificar os fungos adicionados e os já existentes no sedimento. No resultado Microbiológico obteve-se o Reino Fungi, do Filo Ascomycota, dos Gêneros Aspergillus spp e Penicillium spp e espécies Aspergillus flavus, Aspergillus niger. Houve também os contaminantes Mucor spp e Paecilomyces spp. Como já foi apontado anteriormente, este trabalho utiliza como base as espécies Aspergillus spp, mais especificamente Aspergillus flavus e Penicillium spp.

3 RESULTADOS

            Inicialmente foram caracterizados os produtos e substâncias que compõe a mistura microbiológica  para comparação posterior com os resultados do processo de biorremediação. Assim sendo, foi analisada a granulometria com centrifugação do sedimento manguezal coletado em campo contaminado.

Foi obtido o perfil granulométrico inicial coma curva aberta na lateral e menos intensa evidenciando ter ainda material a ser avaliado. Foi então acionada a centrifugação o que permitiu um pico mais vertical e elevado com o resultado de D(v.05) = 23.30 µm com centrifugação para o sedimento manguezal.

Para caracterização dos componentes da Mistura Microbiológica, cada um foi analisado antes da fase experimental de campo em Cromatografia líquida, conforme mostra apresentando o gráfico Ternário. Como resultado da extração das alíquotas de três frações de hidrocarbonetos saturados, aromáticos e NSO, observa-se que existe uma concentração muito elevada, cerca de 97.7% dos compostos NOS, uriundos da glicerina e torta de mamona, os quais irão contribuir para o aumento de MCNR/Kg. 

Outro procedimento de investigação foi realizado como a análise de Nitrogênio total cujo resultado, obtido foi a concentração média de 0,16%, o que se convencionou que seria adicionado 10 g de NPK para cada amostra de simulação.

Como resultado das análises de Fosfato em três amostras de sedimento manguezal contaminado (Tabela 03), foram obtidos concentrações de 14.8 mg/Kg e 14.4 mg/Kg com uma média para as três amostras de sedimento branco de referência de 0.0144mg/Kg.

Durante as 8 semanas de experimental, em aquários, no laboratório de campo, foram tomados os parâmetros físico-químicos e organizados em uma tabela (tabela 04). Com esses resultados foram feitos gráficos do comportamento do pH e Eh o que as simulações evidenciam o aumento do ph e a diminuição do Eh, muito baixo criando condições redutivas, indicando a biorremediação nas transformaçõe bioquímicas.

No inicio e no final, como indica na literatura, o pH se mostrou ácido, entretanto, durante o período de maior biorremediação se manteve neutro entre 7,5 e 8,0. O Eh iniciou com 56 (Mv) e acentuou-se com final mínimo de -99 o que evidencia o processo de biorremediação. Os dados relativos ao pH e potencial redox (Eh) são parâmetros que devem ser observados nos sistemas marinhos ao aferir informações sobre as variações das condições ambientais geoquímicas e a respeito das tendências das degradações dos hidrocarbonetos. 

A fim de acompanhar as transformações bioquímicas foram feito gráficos de salinidade e Eh (Mv), observou-se que a cada duas semanas tem um pico de Eh (Mv) mais baixo, indicando a biorremediação, sendo que na última semana foi menos intenso com menor condição redutiva. Acompanhando-se o desenvolvimento observa-se que: como a água salina dos aquários foi trocada a cada semana, inicialmente se mantinham com pouca salinidade aumentando gradativamente e acentuou-se nas amostras do fungo Penicillium na 6ª semana.

Cada simulação do experimental foi caracterizado por Cromatografia líquida do óleo total obtendo-se, assim, os resultados e detalha o tipo de amostra, numero de hidrocarbonetos, quantidade de hidrocarboneto em mg por Kg de óleo, quantidade de mistura não resolvida em mg por Kg de óleo, quantidade de pristano em mg por Kg de óleo e quantidade em mg de fitano em mg por Kg de óleo.

De posse deste banco de dados específicos resultantes da biorremediação de manguezais contaminados, pode-se fazer várias modalidades de investigação observando o comportamento de cada componente e as transformações de suas substancias para comprovação da biorremediação. Assim sendo pode-se concluir que houve ruptura total por fungos de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, antraceno, fenantreno e pireno, com formação de parafinas alifáticos.

Foram selecionados os resultados obtidos da simulação de Aspergillus e mamona e foram feitos gráficos de cada uma das semanas, acompanhando-se a biorremediação. Foi observado que nas simulações 2, 6, 10, 14, 18, 22 e 26 havia um pico acentuado entre C23 e C24 chegando a atingir 230 m Volts em tempo 20 min, provavelmente de compostos NSO já identificado no Gráfico Ternário. Entretanto na simulação 30 já não ocorre, atribuindo-se que estes (Nitrogênio, Enxofre e Oxigênio) contribuíram para as transformações bioquímicas e quebra da cadeia linear dos hidrocarbonetos. Havendo, portanto uma diminuição do pico e uma acentuada curva da base do cromatograma que indica o aumento de mistura não resolvida e aumento de biorremediação.

Em seguida foram feitos os gráficos das simulações de NPK e Aspergillus o que mostra também nas últimas semanas o aumento da curva da base com mistura não resolvida e da biorremediação. Durante o tempo em que se desenvolveu o experimental no laboratório de campo, foi também desenvolvida a biorremediação com bactéria específicas foi, portanto comparado um dos cromatogramas obtido, para discussão. Entretanto é salientado que o sedimento contaminado manguezal foi escolhido mais compactado com petróleo, enquanto que o sedimento das bactérias foi mais exsudado menos contaminado.

De acordo com o cromatograma de Aspergillus, 60 dias, ouve um aumento de mistura não resolvida (MCNR) e uma elevação na Figura a qual permite sugerir que ouve biorremediação, possivelmente dos hidrocarbonetos aromáticos. Isto se explica no aumento de hidrocarbonetos saturados da cadeia C14 e C15 se destacando. O que não acontece com o cromatograma de bactérias no qual é menor MCNR, entretanto é maior a biorremediação de saturado, do que se conclui que ambos contribuem para o processo de biorremediação.

Quando sobrepostas às fotos dos cromatogramas verifica-se detalhadamente o aumento da base com os compostos NSO e alcanos saturados, ocorrendo também um aumento da curva indicando a biorremediação dos aromáticos da simulação Aspergillus e mamona com 60 dias. 

Foram analisadas as quatro simulações e comparando-se os resultados, o fungo Aspergillus com mamona obteve melhor biorremediação, isto é foi detectado menor quantidade de hidrocarboneto do que o Penicíllium.

Foi calculada a concentração da mistura não resolvida MCNR, que não é reconhecida, identificada, para análise no cromatógrafo para cada uma das analises. Estes procedimentos foram realizados a fim de melhor analisar o aumento de hidrocarbonetos de alcanos de cadeia aberta. Verificou-se que os fungos Aspergillus com NPK obtiveram menor concentração atingindo até 40.000 ppm, o que caracteriza  uma maior biorremediação  seguido por Aspergillus e Penicillium com mamona em torno de 50.000 ppm  e Penicillium com NPK foi o que obteve maior MCNR em até 60.000 ppm (menor biorremediação) .

Foram feitas as alíquotas do extrato e calculado a concentração em ppm pelo tempo em semanas, o valor dos picos em ppm dos HTP do óleo ppm e do MCNP ppm (mg MCNP Kg óleo) dos marcadores Pristano ppm (mg MCNP Kg óleo) e Fitano ppm (mg MCNP Kg óleo). Desta forma foram avaliadas as degradações dos hidrocarbonetos total do sedimento manguezal, e dos cíclicos, fitano e pristano porque estes são de mais difícil degradação, servindo assim de biomarcadores.

Como também ao se comparar os bioetimulantes, o Aspergillus com NPK mostrou-semais eficiente do que o Penicillium e NPK. Ainda, nesta fase, no monitoramento geoquímico que visa avaliar as diversas etapas da degradação do contaminante. Foram coletadas amostras periódicas e realizado sua caracterização incluindo análise por processos cromatográficos, líquido acoplado à EM.

Com o objetivo de pesquisar o aumento de hidrocarboneto em fluidez na mistura microbiológica após a biorremediação foram feitas as normalizações da área total dos hidrocarbonetos totais de n-C14 à n-C40 com Aspergillus e mamona e do  Aspergillus e NPK. Houve um aumento de hidrocarbonetos entre as cadeias menores entre C18 e C19 e entre C23 à C 25, ainda entre C33 à C38.

Verificou-se que nas simulações de Aspergillus com NPK ouve um acréscimo de hidrocarbonetos maior em relação ao Aspergillus com mamona e em relação ao referencial branco principalmente entre C-22 e C-24, e mais predominante entre as cadeias carbônicas de C-33, 34, 35 e em C-38 e C-39. Verificou-se também que, a adição de nutrientes nitrogenados, contribuiu para as transformações bioquímicas.

Utilizando a técnica de Fluorescência de Raios-X foi possível analisar a contribuição dos inorgânicos na biorremediação, os quais contribuem para as transformações bioquímicas dos compostos. Dentre os elementos que contribuíram para a biorremediação, o enxofre, presente no petróleo e na mamona tornou-se o principal agente nas reações bioquímicas com o aminoácido cisteína da ricina de mamona. Inicialmente foi feito a análise do sedimento manguezal. Na seqüência foram analisadas as amostras colhidas durante as 8 semanas de biorremediação.

Destaca-se na 1ª semana o cloro proveniente da solução salina de produção, enquanto que na última semana do experimento aumenta o percentual de silício e o cloro é carreado em reações bioquímicas em outros compostos. Desse modo, produz uma emulsão superficial de biopolímeros orgânicos na solução aquosa do tanque aquário experimental. Foi investigada a transformação bioquímica existente durante o processo de biorremediação com ricina da mamona e Fungos.

Durante a análise visual da Solução Salina, percebeu-se que, com 4 dias, a simulação com o fungo Aspergillus sp e o bioestímulo torta de mamona gerou, em cima da água, uma camada de emulsão oleosa, que passou a ficar escura e turva. Com 15 dias, a solução apresentava-se muito escura, com fermentação dos fungos e emulsão na superfície. Já com 34 dias, as substâncias que estavam emulsificadas formaram uma película, enquanto que a solução salina tornou-se de cor clara, sem espuma. Estas foram analisadas em XRF e Infravermelho e identificadas como Biopolímeros Protéicos. Como forma de biorremediação do sedimento contaminado, resultou pela ação dos fungos a transformação de substâncias HPAs em moléculas menores e voláteis, lançadas para a solução salina, vindo a reagir com a enzima da proteína vegetal ricina da mamona.

Foi investigada a contribuição dos metais em % durante 8 semanas da simulação de Penicillium com mamona e Penicillium com NPK. Verificou-se um aumento de metalóides na última semana de Penicíllium com mamona em quase todos os metalóides. A 1ª semana de Penicillium com NPK foi o índice percentual de menor relevância.

Nas semeaduras em placas de Petri não utilizadas no experimental de campo foi observado, após 90 dias da semeadura desses fungos, que haviam se desenvolvido, na parte superficial das placas, maior proliferação e concentração da população fúngica. Notaram-se acima dos esporos dos fungos, pequenos cristais sólidos, transparentes e com brilho (Capítulo 5). Os cristais foram produzidos a partir dos rejeitos dos fungos, isto é, filamentos dos quais se serviam como seus esporos, e provavelmente da captura dos hidrocarbonetos voláteis em sais minerais de halita. Estes foram cristalizados a partir do fator tempo, quanto mais tempo em dias, mais produziu cristalização de forma quadrada, em filetes tipo agulhas, por isso foi feita a 2ª semeadura com o fator tempo após 90 dias com cristais em filetes maiores. Com o processo de cristalização resultando no produto cristal, foi desenvolvido um diagrama esquemático para a caraterização química orgânica e inorgânica, após a coleta e seleção com identificação do Cristal Proteico de Amida.

Foram comparadas as análises de infravermelho do Biopolímero e             Cristal Protéio, como resultado, foi constatado os picos nitogenados e halogenados atuando em reações de transformações de diferentes tempos, locais, estado físico e, finalmente, na produção de produtos. Podem-se verificar os mesmos compostos orgânicos dos grupos funcionais que se obteve com a análise de infravermelho do produto residual cristalizado. Porém, a transmitância da película membranar se efetiva de 0 a 40%, enquanto que a transmitância, fração de energia luminosa, incidente do comprimento de onda do cristal se efetiva acima de 30 a 60 %. Observou-se em ambos os espectros o pico X= 1.637 de amidas secundárias.

           Fig. Processo de biorremediação fungos Aspergillus spp, sintetização de biopolímero

Após a obtenção dos resultados foi feito estatisticamente a Análise Covariante dos Dados - PCA e se analisou a maior e menor biorremediação das amostras de Aspergillus e mamona e Aspergillus e NPK. Sendo que para Aspergillus e mamona obteve-se no fator (2) 23,19%, com maior concentração dos HTP na amostra 14 e menor concentração na amostra 18 (4ª semana). Para o fungo Aspergillus e NPK obteve-se no fator (2) 21,72 %, com maior concentração na amostra 13.

Foi comparado em gráficos estatísticos os resultados de cromatografia com relação aos inorganicos de XRF e observou-se que com Aspergillus e torta de mamona há uma maior degradação de MCNR (aromáticos) com a influencia de Enxofre e Potássio. No entanto há uma inibição da degradação com Titânio e Cálcio.

Com o fungo Aspergillus e o bioestímulo NPK ouve uma maior degradação de MCNR (aromáticos) com Zircônio e Manganês e menor degradação com Vanádio.

No capítulo 4, tem-se o artigo 1 que trata da mistura microbiológica a qual foi aplicada na biorremediação de campo desse trabalho. Explica como foi concebida e comprova a sua eficiência através das técnicas de XRF e cromatografia gasosa. 

No capítulo 5, tem-se o artigo 2, que trata do procedimento e validação da biorremediação propriamente dita, com a identificação do sub-produto biopolímero. Discute os dados de validação através das técnicas de XRF, cromatografia gasosa e infravermelho. 

No capítulo 6, tem-se o artigo 3 que trata do produto específico Cristal Protéico de Amida. Discute a caracterização da composição química do cristal através das técnicas de XRF, cromatografia gasosa, infravermelho e difratometria de Raios-X. Esse artigo será publicado posteriormente em revista específica ainda não definida.

Nos Apêndices estão expressos outros resultados obtidos com a pesquisa desenvolvida bem como solicitações de depósitos de Patentes de Invenção (PI).

Destaca-se que as patentes solicitadas são:

1 – (Apêndice H) Universidade Federal da Bahia, Instituto de Química, Instituto de Geociências. Cristina Maria Quintella; Odete Gonçalves; Patente de Invenção BR 221109478318 - PROCESSO MICROBIOLÓGICO PARA CAPTURA DE VOLÁTEIS E PRODUÇÃO DE BIOPOLÍMERO PROTÉICO, 2011.

2 – (Apêndice I) Universidade Federal da Bahia, Instituto de Química, Instituto de Geociências. Cristina Maria Quintella; Odete Gonçalves; Jorge Alberto Trigüis; Patente BR 221109478199 - PROCESSO PARA OBTENÇÃO DE BIOSSENSORES E BIOSSENSORES, 2011.

3 – (Apêndice J) Universidade Federal da Bahia, Instituto de Química, Instituto de Geociências. Cristina Maria Quintella; Odete Gonçalves; Patente de Invenção BR ESTAÇÃO DE TRATAMENTO SUBTERRÂNEA PARA DERRAMES DE PETRÓLEO OU ESGÔTO COM APLICAÇÃO DE MISTURA MICROBIOLÓGICA E MÉTODO DE FUNCIONAMENTO, (em sigilo), 2012.

Além disso, nos Anexos encontram-se resumos e artigos apresentados em congresso, anexo da Figuras da proteína ricina e dos aminoácidos cisteína, e fotos do experimental de campo durante o desenvolvimento dos trabalhos.