PATENTE: PROCESSO MICROBIOLÓGICO PARA CAPTURA DE VOLÁTEIS E PRODUÇÃO DE BIOPOLÍMERO PROTEICO

QUINTELLA, C.; GONÇALVES, O.; Processo microbiológico para captura de voláteis e produção de biopolímero proteico. Depósito Patente de Invenção UFBA em 21/10/2011, 

Campo da invenção

A presente invenção trata da produção de biopolímeros obtidos sob a forma uma película resistente e gelatinosa. Tais biopolímeros são provenientes da reação de hidrocarbonetos do petróleo e outras fontes e proteínas vegetais armazenadas como energia em células de fungos. Os referidos fungos metabolizam esses materiais, devolvendo ao ambiente o residual sintetizado.

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FIG. 1

FIG. 2

FIG. 3

FIG. 4

RESUMO

PROCESSO MICROBIOLÓGICO PARA CAPTURA DE VOLÁTEIS E PRODUÇÃO DE BIOPOLÍMERO PROTEICO

A presente invenção refere-se a um processo microbiológico para captura de voláteis na produção de biopolímero protéico e biopolímero produzido. Mais especificamente, à produção de biopolímeros compactados, termoplástico, película filamentosa, proveniente de sedimento manguezal contaminado com hidrocarboneto do petróleo ou outros e proteínas vegetais armazenadas como energia em células dos fungos, que utilizam para sua co-metabolização devolvendo ao ambiente o residual sintetizado cuja aplicação possui larga variedade na indústria de produtos e revestimentos e na área medicinal.

Mais particularmente a presente invenção refere-se a um filme de película sintelizado por um grupo protéico amida com moléculas e elementos minerais essenciais à vida, produtores de biomassa com utilização em outros processos de formação e aplicação industrial.

PATENTE: PROCESSO PARA OBTENÇÃO DE BIOSSENSORES E BIOSSENSORES

 Carta Patente de Invenção II

QUINTELLA, M. C.; GONÇALVES, O.;TRIGUIS, A. J.; BR PI UFBA Patente 221109478199 - Processo para obtenção de biossensores e biossensores, 2011.

Campo da invenção

A presente invenção trata de um processo para obtenção de um produto salino cristalizado o qual encerra na sua composição uma enzima protéica com características próprias para emprego na produção de biossensores, os quais têm aplicação na indústria farmacêutica, medicinal, biotecnológica e eletrônica.

FIG. 1

FIG. 2

RESUMO

PROCESSO PARA OBTENÇÃO DE BIOSSENSORES E BIOSSENSORES

A presente invenção trata de um processo de obtenção de um produto biossensor e biossensor, o qual é obtido a partir de componentes voláteis encontrados em manguezais contaminados com hidrocarbonetos. O produto biossensor compreende uma proteína amida obtida a partir da reação de cristalização em meio salino de contaminantes voláteis de manguezais, quando submetidos à processo de biorremediação com fungos Aspergillus sp, dentre outros. Os produtos obtidos possuem características eletromagnéticas, produzindo um sinal eletrônico proporcional à concentração de determinados elementos presentes em uma amostra. 

Processo e obtenção de produto biodegradável para biorremediação de áreas impactadas com petróleo com um consórcio de 1ª geração de biocombustíveis.

Odete Gonçalves¹* (TC), Cristina M. Quintella¹ (PQ). (Cristina@ufba.br)

Palavras Chave: Mamona, Biocombustíveis, Biorremediação,  Aspergillus fumicatus

1 - Introdução

          

A biorremediação é desenvolvida sob a ação de microorganismos é um método cientificamente comprovado e ecologicamente correto com sustentabilidade. É uma das  formas de remediação ocasionada por microorganismos que apresentam capacidade de metabolizar os componentes e transformá-los em substancias inertes CO2 e água.  Usualmente se utilizam bactérias, sendo que o uso de fungos autóctones ainda é pouco explorado, tendo a vantagem de ser menos agressivo ao ambiente. Aqui se aplica um consórcio de 1ª geração de bicombustíveis, sendo sustentável e renovável com fungos que permitem o processo enzimático da mistura microbiológica: petróleo, água de produção, glicerina bruta e torta de mamona, areia calcinada e fungos.

Os meios escolhidos de crescimento ativam e aceleram a cometabolização dos hidrocarbonetos e tem aplicação na remediação de áreas impactadas por petróleo em manguezais e ambientes oleosos.                                

           

2 - Material e Métodos

Inicialmente foram caracterizados os produtos e substanciam da mistura microbiológica com análises físico-química e técnica de Fluorimetria do petróleo, glicerina bruta, e fungos. Fluorescência de RX em areia calcinada, em toxicologia foi isolado e identificado o fungo Aspergillus fumicatus. A mistura microbiológica foi composta de resíduo de petróleo 13,25%, areia calcinada 38,46% na 25% Ø ≈48 mesh, água de produção 32,05%, glicerina bruta 12,82% e torta de mamona 3,37%. Foram levados ao aquecedor agitador magnético, na temperatura de 70 até 97^OC em agitação constante onde permaneceu por 4 min; após em descanso, foi adicionado cepas do fungo filamentoso Aspergillus fumicatus..

Tabela 01. Tabela dos produtos e valores em percentagem da mistura microbiológica

Produtos	Valor %
Resíduo de petróleo	13,25
Torta de mamona	3,37
Glicerina de mamona	12,82
Areia calcinada	38,46
Água de produção	32,05

A mistura foi lacrada e acompanhado o período de incubação com a proliferação dos fungos. Houve um processo de transformação bioquímico e observou-se a liberação de gases. Foram analisadas alíquotas nos dias zero, 24, 32, 90, 257 e 437 dias, por cromatografia para monitorar a presença de parafinas e por espectrofluorimetria para monitorar os fluoróforos.

Figura 1. Por cromatografia picos de hidrocarbonetos em com aumento da concentração relativa C22, criseno e C28.

      

Cromatografia técnica de separação de misturas e identificação de seus componentes. Esta depende da diferença entre as interações dos analitos, a fase móvel e a fase estacionária. Foi usado o aparelho espectrofluorímetro Perkin Elmer–LS55. As amostras foram analisadas em cubetas de quartzo de 1cm de secção quadrada. Foi monitorado pico de ativação, crescimento/decaimento no processo microbiológico dos fungos a transformação das substancias (enzimas orgânicas).

Figura 2: Mapas espectrofluriométricos das amostras zero dia e 90 dias.

              Os resultados foram analisados no programa Origin® com a elaboração de mapas e gráficos de fluorescência molecular. A biorremediação microbiológica se efetiva inicialmente com a proteína vegetal e o fungo e posteriormente com o aumento da população fúngica o consumo de hidrocarbonetos.  Adicionalmente, utiliza a proteína vegetal inibidora ricina na fermentação alcoólica como fonte de energia para os fungos modificando a atividade enzimática e favorecendo a mineralização de compostos minerais com os metais de transição como oxido de cádmium provenientes da areia calcinada. A glicerina bruta, co-produto da produção do biodiesel, contém uma mistura de glicerina, ácidos, ésteres, álcalis, e alcoóis, óleo, gliceróis, água e sais variados. A presença da glicerina bruta com suas impurezas altera a tensão interfacial, atua na viscosidade e permite que o fungo atue de modo mais intenso sobre a ricina.

3 - Resultados e Discussão

           

A cromatografia mostrou que as amostras do tempo zero sem fungos, a existência de 6 picos atribuídos a antraceno, ferantreno, pireno, C22, criseno, C28. Já no tempo 32 dias, mostrou a ausência dos picos correspondente a antraceno, ferantreno e pireno e o aumento da concentração relativa a C22, criseno e C28 devido a redução da concentração dos demais, identificando o efeito de biorremediação referente a hidrocarbonetos.

            Em fluorescência inicialmente o máximo de excitação em 300nm o que migrou para 390 à 460nm que se explica pelo aumento de concentração relativa de HPAs, devido ao consumo de hidrocarbonetos lineares, após 90 dias a fluorescência reduziu drasticamente pelo consumo dos HPAs

Figura 3: Intensidade (u.arb.) de fluorescência induzida excitação 300 nm, para amostras com diferentes tempos de atuação do produto biodegradável.

            Em fluorescência inicialmente o máximo de excitação em 300nm o que migrou para 390 à 460nm que se explica pelo aumento de concentração relativa de HPAs, devido ao consumo de hidrocarbonetos lineares, após 90 dias a fluorescência reduziu drasticamente pelo consumo dos HPAs. Assim se efetivou a aplicação do processo de obtenção de um produto biodegradável para emprego em processos de biorremediação de manguezais e áreas impactadas por derrames de petróleo e derivados, o qual é incorporado ao meio contaminado e que se pretende remediar.

Figura 4: Fluorescência com excitação a 300 nm, das amostras contaminadas sem ação do produto e com ação do produto por 257 dias

            Os fungos são capazes de produzir um sistema enzimático responsável pela degradação de compostos xenobióticos. O processo microbiológico aqui proposto envolve o fungo Aspergillus fumigatus, com a mamona Ricinus communis, sendo uma forma natural e efetiva da natureza resolver seus desequilíbrios através dos seus próprios caminhos como a catálise enzimática, onde extrai seu substrato e faz a organocatálise, em cetonas (compostos cíclicos).   Produzem enzimas extracelulares oxidativas, capazes de quebrar compostos de policíclicos aromáticos de cadeia longa em compostos assimiláveis ao seu metabolismo. Na etapa final os nutrientes ficam escassos e a colônia fúngica passa a processar os materiais disponíveis no meio, que são os contaminantes hidrocarbonetos, e ocorre a biorremediação do meio, com liberação de água e de dióxido de carbono. Deste modo foi possível comprovar que com o emprego do produto, em até 32 dias se dá a biorremediação para hidrocarbonetos lineares e que em até 90 dias se dá a biorremediação para HPAs.

           

4 - Agradecimentos

       Laboratório de XRF/ UFBA pelas análises de areias calcinadas, ao Laboratório Análises Toxicológicas IBIO/UFBA pelo isolamento e identificação do fungo, e ao Instituto Politécnica UFBA pela glicerina e torta de mamona. E a Maxidril Equipamentos E&P por conceder resíduo de petróleo.

5 - Bibliografia

[1] Proteolytic enzymes: A pratical approach. Beynom,R.J., Bond,J.S (eds).1989. Academic press. Oxford.

2 Azevedo, W.F., & Santos, D.S. (2004). Acta Crystallogr. Sect. D.-Biol. Crystallogr. 60, 2003-2005.

³ CUNHA, 1996. Semina: revista cultural e científica da Universidade Estadual de Londrina Volumes 20-21, pg. 68, Universidade do Texas, 18 nov. 2008.

⁴ Quintella, C.M., Gonçalves, O. Patente “Processo de obtenção de produto biodegradável para aplicação na remediação de solos, águas e ambientes impactados e método de funcionamento”, 2010.

RESULTADOS OBTIDOS

B)    Processo de Cristalização na Biorremediação

            Após a quantificação percentual de cada produto que compõe a mistura microbiológica equivalente à Patente de Inovação UFBA 2010, estes foram homogeneizados e colocados em placas de Petri fechadas. Estes procedimentos foram feitos por etapa, inicialmente a fim de serem repicadas as semeaduras nos aquários de experimental, protótipo de campo para biorremediação. Em segundo para serem observadas as reações bioquímicas,  entre microorganismos (fungos) e as substancias organicas e inorganicas presente na mistura de hidrocarbonetos, sedimento e recina de mamona, além da presença da solução salina  os quais são determinados pelo tempo e volatilização para o processo de cristalização protéica.

                        Fig. Mistura Microbiológica após 90 dias em processo de cristalização

1.      2. 1 Caracterização dos Cristais Protéicos

Sabe-se que o cristal Halita (NaCl) também é o responsável pelos compostos com ligação iônica. Para investigação dos possíveis elementos inorgânicos que estão contribuindo na biorremediação foi analisado de Fluorescência de Raios-X, e Difratometria de Raios-X. Para tal análise, selecionou-se os cristais em aparelho de Lupa Eletrônica, foram macerados e condicionados, obtendo-se o 7º resultado de XRF e 8º resultado, Difratometria de Raios-X.  Para comprovação foi realizada a semeadura 2 para comparação com o fator tempo, o antes e depois de 90 dias e analisado por Difratometria de Raio-X. Outra metodologia empregada foi para analisar o residual de produto microbiológico cristalizado em infravermelho. Fez-se pastilhas de boro, obtendo-se a origem orgânica do produto.

2. 2. 2 Formação de película, biopolímero durante a biorremediação

Percebeu-se que, com 4 dias, a simulação com o fungo Aspergillus spp e o bioestímulo torta de mamona gerou, em cima da água, uma camada de emulsão oleosa, redução e mobilidade, que passou a ficar escura e turva. Com 15 dias, a solução apresentava-se muito escura, com fermentação de fungos e emulsão na superfície. Já com 34 dias, as substâncias que estavam emulsificadas formaram uma película biopolímeros, enquanto que a solução salina tornou-se de cor clara, sem espuma e com resíduo de sedimento no fundo. Provavelmente o biopolímero foi sintetizado pelo processo de transformação bioquímica e microbiológica dos fungos, para o seu metabolismo e assimilação. Este processo de polimerização residual foi analisado em infravermelho (Capítulo 4). Pode-se então fazer uma comparação entre os dois resultados de infravermelho, do biopolímero e do cristal protéico.

A composição inorgânica da membrana biopolímero foi investigada com base nos dados dos de XRF, comparando a produção dos fungos Aspergillus spp, seco e gelatinoso com amostras dos Penicillium spp , gelatinoso.

                     Fig. Foto Microscopia Eletrônica de Varredura 0.05 mm de Biopolímero

2.  2. 3 Análise Microbiológica e caracterização dos fungos durante o período de biorremediação

            As amostras colhidas no experimental do laboratório de campo foram enviadas ao Laboratório de Toxicologia de Farmácia da UFBA analisadas, com o objetivo de acompanhar, isolar e identificar os fungos adicionados e os já existentes no sedimento. No resultado Microbiológico obteve-se o Reino Fungi, do Filo Ascomycota, dos Gêneros Aspergillus spp e Penicillium spp e espécies Aspergillus flavus, Aspergillus niger. Houve também os contaminantes Mucor spp e Paecilomyces spp. Como já foi apontado anteriormente, este trabalho utiliza como base as espécies Aspergillus spp, mais especificamente Aspergillus flavus e Penicillium spp.

3 RESULTADOS

            Inicialmente foram caracterizados os produtos e substâncias que compõe a mistura microbiológica  para comparação posterior com os resultados do processo de biorremediação. Assim sendo, foi analisada a granulometria com centrifugação do sedimento manguezal coletado em campo contaminado.

Foi obtido o perfil granulométrico inicial coma curva aberta na lateral e menos intensa evidenciando ter ainda material a ser avaliado. Foi então acionada a centrifugação o que permitiu um pico mais vertical e elevado com o resultado de D(v.05) = 23.30 µm com centrifugação para o sedimento manguezal.

Para caracterização dos componentes da Mistura Microbiológica, cada um foi analisado antes da fase experimental de campo em Cromatografia líquida, conforme mostra apresentando o gráfico Ternário. Como resultado da extração das alíquotas de três frações de hidrocarbonetos saturados, aromáticos e NSO, observa-se que existe uma concentração muito elevada, cerca de 97.7% dos compostos NOS, uriundos da glicerina e torta de mamona, os quais irão contribuir para o aumento de MCNR/Kg. 

Outro procedimento de investigação foi realizado como a análise de Nitrogênio total cujo resultado, obtido foi a concentração média de 0,16%, o que se convencionou que seria adicionado 10 g de NPK para cada amostra de simulação.

Como resultado das análises de Fosfato em três amostras de sedimento manguezal contaminado (Tabela 03), foram obtidos concentrações de 14.8 mg/Kg e 14.4 mg/Kg com uma média para as três amostras de sedimento branco de referência de 0.0144mg/Kg.

Durante as 8 semanas de experimental, em aquários, no laboratório de campo, foram tomados os parâmetros físico-químicos e organizados em uma tabela (tabela 04). Com esses resultados foram feitos gráficos do comportamento do pH e Eh o que as simulações evidenciam o aumento do ph e a diminuição do Eh, muito baixo criando condições redutivas, indicando a biorremediação nas transformaçõe bioquímicas.

No inicio e no final, como indica na literatura, o pH se mostrou ácido, entretanto, durante o período de maior biorremediação se manteve neutro entre 7,5 e 8,0. O Eh iniciou com 56 (Mv) e acentuou-se com final mínimo de -99 o que evidencia o processo de biorremediação. Os dados relativos ao pH e potencial redox (Eh) são parâmetros que devem ser observados nos sistemas marinhos ao aferir informações sobre as variações das condições ambientais geoquímicas e a respeito das tendências das degradações dos hidrocarbonetos. 

A fim de acompanhar as transformações bioquímicas foram feito gráficos de salinidade e Eh (Mv), observou-se que a cada duas semanas tem um pico de Eh (Mv) mais baixo, indicando a biorremediação, sendo que na última semana foi menos intenso com menor condição redutiva. Acompanhando-se o desenvolvimento observa-se que: como a água salina dos aquários foi trocada a cada semana, inicialmente se mantinham com pouca salinidade aumentando gradativamente e acentuou-se nas amostras do fungo Penicillium na 6ª semana.

Cada simulação do experimental foi caracterizado por Cromatografia líquida do óleo total obtendo-se, assim, os resultados e detalha o tipo de amostra, numero de hidrocarbonetos, quantidade de hidrocarboneto em mg por Kg de óleo, quantidade de mistura não resolvida em mg por Kg de óleo, quantidade de pristano em mg por Kg de óleo e quantidade em mg de fitano em mg por Kg de óleo.

De posse deste banco de dados específicos resultantes da biorremediação de manguezais contaminados, pode-se fazer várias modalidades de investigação observando o comportamento de cada componente e as transformações de suas substancias para comprovação da biorremediação. Assim sendo pode-se concluir que houve ruptura total por fungos de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, antraceno, fenantreno e pireno, com formação de parafinas alifáticos.

Foram selecionados os resultados obtidos da simulação de Aspergillus e mamona e foram feitos gráficos de cada uma das semanas, acompanhando-se a biorremediação. Foi observado que nas simulações 2, 6, 10, 14, 18, 22 e 26 havia um pico acentuado entre C23 e C24 chegando a atingir 230 m Volts em tempo 20 min, provavelmente de compostos NSO já identificado no Gráfico Ternário. Entretanto na simulação 30 já não ocorre, atribuindo-se que estes (Nitrogênio, Enxofre e Oxigênio) contribuíram para as transformações bioquímicas e quebra da cadeia linear dos hidrocarbonetos. Havendo, portanto uma diminuição do pico e uma acentuada curva da base do cromatograma que indica o aumento de mistura não resolvida e aumento de biorremediação.

Em seguida foram feitos os gráficos das simulações de NPK e Aspergillus o que mostra também nas últimas semanas o aumento da curva da base com mistura não resolvida e da biorremediação. Durante o tempo em que se desenvolveu o experimental no laboratório de campo, foi também desenvolvida a biorremediação com bactéria específicas foi, portanto comparado um dos cromatogramas obtido, para discussão. Entretanto é salientado que o sedimento contaminado manguezal foi escolhido mais compactado com petróleo, enquanto que o sedimento das bactérias foi mais exsudado menos contaminado.

De acordo com o cromatograma de Aspergillus, 60 dias, ouve um aumento de mistura não resolvida (MCNR) e uma elevação na Figura a qual permite sugerir que ouve biorremediação, possivelmente dos hidrocarbonetos aromáticos. Isto se explica no aumento de hidrocarbonetos saturados da cadeia C14 e C15 se destacando. O que não acontece com o cromatograma de bactérias no qual é menor MCNR, entretanto é maior a biorremediação de saturado, do que se conclui que ambos contribuem para o processo de biorremediação.

Quando sobrepostas às fotos dos cromatogramas verifica-se detalhadamente o aumento da base com os compostos NSO e alcanos saturados, ocorrendo também um aumento da curva indicando a biorremediação dos aromáticos da simulação Aspergillus e mamona com 60 dias. 

Foram analisadas as quatro simulações e comparando-se os resultados, o fungo Aspergillus com mamona obteve melhor biorremediação, isto é foi detectado menor quantidade de hidrocarboneto do que o Penicíllium.

Foi calculada a concentração da mistura não resolvida MCNR, que não é reconhecida, identificada, para análise no cromatógrafo para cada uma das analises. Estes procedimentos foram realizados a fim de melhor analisar o aumento de hidrocarbonetos de alcanos de cadeia aberta. Verificou-se que os fungos Aspergillus com NPK obtiveram menor concentração atingindo até 40.000 ppm, o que caracteriza  uma maior biorremediação  seguido por Aspergillus e Penicillium com mamona em torno de 50.000 ppm  e Penicillium com NPK foi o que obteve maior MCNR em até 60.000 ppm (menor biorremediação) .

Foram feitas as alíquotas do extrato e calculado a concentração em ppm pelo tempo em semanas, o valor dos picos em ppm dos HTP do óleo ppm e do MCNP ppm (mg MCNP Kg óleo) dos marcadores Pristano ppm (mg MCNP Kg óleo) e Fitano ppm (mg MCNP Kg óleo). Desta forma foram avaliadas as degradações dos hidrocarbonetos total do sedimento manguezal, e dos cíclicos, fitano e pristano porque estes são de mais difícil degradação, servindo assim de biomarcadores.

Como também ao se comparar os bioetimulantes, o Aspergillus com NPK mostrou-semais eficiente do que o Penicillium e NPK. Ainda, nesta fase, no monitoramento geoquímico que visa avaliar as diversas etapas da degradação do contaminante. Foram coletadas amostras periódicas e realizado sua caracterização incluindo análise por processos cromatográficos, líquido acoplado à EM.

Com o objetivo de pesquisar o aumento de hidrocarboneto em fluidez na mistura microbiológica após a biorremediação foram feitas as normalizações da área total dos hidrocarbonetos totais de n-C14 à n-C40 com Aspergillus e mamona e do  Aspergillus e NPK. Houve um aumento de hidrocarbonetos entre as cadeias menores entre C18 e C19 e entre C23 à C 25, ainda entre C33 à C38.

Verificou-se que nas simulações de Aspergillus com NPK ouve um acréscimo de hidrocarbonetos maior em relação ao Aspergillus com mamona e em relação ao referencial branco principalmente entre C-22 e C-24, e mais predominante entre as cadeias carbônicas de C-33, 34, 35 e em C-38 e C-39. Verificou-se também que, a adição de nutrientes nitrogenados, contribuiu para as transformações bioquímicas.

Utilizando a técnica de Fluorescência de Raios-X foi possível analisar a contribuição dos inorgânicos na biorremediação, os quais contribuem para as transformações bioquímicas dos compostos. Dentre os elementos que contribuíram para a biorremediação, o enxofre, presente no petróleo e na mamona tornou-se o principal agente nas reações bioquímicas com o aminoácido cisteína da ricina de mamona. Inicialmente foi feito a análise do sedimento manguezal. Na seqüência foram analisadas as amostras colhidas durante as 8 semanas de biorremediação.

Destaca-se na 1ª semana o cloro proveniente da solução salina de produção, enquanto que na última semana do experimento aumenta o percentual de silício e o cloro é carreado em reações bioquímicas em outros compostos. Desse modo, produz uma emulsão superficial de biopolímeros orgânicos na solução aquosa do tanque aquário experimental. Foi investigada a transformação bioquímica existente durante o processo de biorremediação com ricina da mamona e Fungos.

Durante a análise visual da Solução Salina, percebeu-se que, com 4 dias, a simulação com o fungo Aspergillus sp e o bioestímulo torta de mamona gerou, em cima da água, uma camada de emulsão oleosa, que passou a ficar escura e turva. Com 15 dias, a solução apresentava-se muito escura, com fermentação dos fungos e emulsão na superfície. Já com 34 dias, as substâncias que estavam emulsificadas formaram uma película, enquanto que a solução salina tornou-se de cor clara, sem espuma. Estas foram analisadas em XRF e Infravermelho e identificadas como Biopolímeros Protéicos. Como forma de biorremediação do sedimento contaminado, resultou pela ação dos fungos a transformação de substâncias HPAs em moléculas menores e voláteis, lançadas para a solução salina, vindo a reagir com a enzima da proteína vegetal ricina da mamona.

Foi investigada a contribuição dos metais em % durante 8 semanas da simulação de Penicillium com mamona e Penicillium com NPK. Verificou-se um aumento de metalóides na última semana de Penicíllium com mamona em quase todos os metalóides. A 1ª semana de Penicillium com NPK foi o índice percentual de menor relevância.

Nas semeaduras em placas de Petri não utilizadas no experimental de campo foi observado, após 90 dias da semeadura desses fungos, que haviam se desenvolvido, na parte superficial das placas, maior proliferação e concentração da população fúngica. Notaram-se acima dos esporos dos fungos, pequenos cristais sólidos, transparentes e com brilho (Capítulo 5). Os cristais foram produzidos a partir dos rejeitos dos fungos, isto é, filamentos dos quais se serviam como seus esporos, e provavelmente da captura dos hidrocarbonetos voláteis em sais minerais de halita. Estes foram cristalizados a partir do fator tempo, quanto mais tempo em dias, mais produziu cristalização de forma quadrada, em filetes tipo agulhas, por isso foi feita a 2ª semeadura com o fator tempo após 90 dias com cristais em filetes maiores. Com o processo de cristalização resultando no produto cristal, foi desenvolvido um diagrama esquemático para a caraterização química orgânica e inorgânica, após a coleta e seleção com identificação do Cristal Proteico de Amida.

Foram comparadas as análises de infravermelho do Biopolímero e             Cristal Protéio, como resultado, foi constatado os picos nitogenados e halogenados atuando em reações de transformações de diferentes tempos, locais, estado físico e, finalmente, na produção de produtos. Podem-se verificar os mesmos compostos orgânicos dos grupos funcionais que se obteve com a análise de infravermelho do produto residual cristalizado. Porém, a transmitância da película membranar se efetiva de 0 a 40%, enquanto que a transmitância, fração de energia luminosa, incidente do comprimento de onda do cristal se efetiva acima de 30 a 60 %. Observou-se em ambos os espectros o pico X= 1.637 de amidas secundárias.

           Fig. Processo de biorremediação fungos Aspergillus spp, sintetização de biopolímero

Após a obtenção dos resultados foi feito estatisticamente a Análise Covariante dos Dados - PCA e se analisou a maior e menor biorremediação das amostras de Aspergillus e mamona e Aspergillus e NPK. Sendo que para Aspergillus e mamona obteve-se no fator (2) 23,19%, com maior concentração dos HTP na amostra 14 e menor concentração na amostra 18 (4ª semana). Para o fungo Aspergillus e NPK obteve-se no fator (2) 21,72 %, com maior concentração na amostra 13.

Foi comparado em gráficos estatísticos os resultados de cromatografia com relação aos inorganicos de XRF e observou-se que com Aspergillus e torta de mamona há uma maior degradação de MCNR (aromáticos) com a influencia de Enxofre e Potássio. No entanto há uma inibição da degradação com Titânio e Cálcio.

Com o fungo Aspergillus e o bioestímulo NPK ouve uma maior degradação de MCNR (aromáticos) com Zircônio e Manganês e menor degradação com Vanádio.

No capítulo 4, tem-se o artigo 1 que trata da mistura microbiológica a qual foi aplicada na biorremediação de campo desse trabalho. Explica como foi concebida e comprova a sua eficiência através das técnicas de XRF e cromatografia gasosa. 

No capítulo 5, tem-se o artigo 2, que trata do procedimento e validação da biorremediação propriamente dita, com a identificação do sub-produto biopolímero. Discute os dados de validação através das técnicas de XRF, cromatografia gasosa e infravermelho. 

No capítulo 6, tem-se o artigo 3 que trata do produto específico Cristal Protéico de Amida. Discute a caracterização da composição química do cristal através das técnicas de XRF, cromatografia gasosa, infravermelho e difratometria de Raios-X. Esse artigo será publicado posteriormente em revista específica ainda não definida.

Nos Apêndices estão expressos outros resultados obtidos com a pesquisa desenvolvida bem como solicitações de depósitos de Patentes de Invenção (PI).

Destaca-se que as patentes solicitadas são:

1 – (Apêndice H) Universidade Federal da Bahia, Instituto de Química, Instituto de Geociências. Cristina Maria Quintella; Odete Gonçalves; Patente de Invenção BR 221109478318 - PROCESSO MICROBIOLÓGICO PARA CAPTURA DE VOLÁTEIS E PRODUÇÃO DE BIOPOLÍMERO PROTÉICO, 2011.

2 – (Apêndice I) Universidade Federal da Bahia, Instituto de Química, Instituto de Geociências. Cristina Maria Quintella; Odete Gonçalves; Jorge Alberto Trigüis; Patente BR 221109478199 - PROCESSO PARA OBTENÇÃO DE BIOSSENSORES E BIOSSENSORES, 2011.

3 – (Apêndice J) Universidade Federal da Bahia, Instituto de Química, Instituto de Geociências. Cristina Maria Quintella; Odete Gonçalves; Patente de Invenção BR ESTAÇÃO DE TRATAMENTO SUBTERRÂNEA PARA DERRAMES DE PETRÓLEO OU ESGÔTO COM APLICAÇÃO DE MISTURA MICROBIOLÓGICA E MÉTODO DE FUNCIONAMENTO, (em sigilo), 2012.

Além disso, nos Anexos encontram-se resumos e artigos apresentados em congresso, anexo da Figuras da proteína ricina e dos aminoácidos cisteína, e fotos do experimental de campo durante o desenvolvimento dos trabalhos.

DERRAME DE PETRÓLEO

BIORREMEDIAÇÃO DE SUBSTRATO DE MANGUEZAL CONTAMINADO COM PETRÓLEO, ATRAVÉS DA ADIÇÃO DE NUTRIENTES (GLICERINA BRUTA E TORTA DE MAMONA) E FUNGOS Aspergillus spp ou Penicillium spp

BIORREMEDIAÇÃO DE SUBSTRATO DE MANGUEZAL CONTAMINADO COM PETRÓLEO, ATRAVÉS DA ADIÇÃO DE NUTRIENTES (GLICERINA BRUTA E TORTA DE MAMONA) E FUNGOS Aspergillus spp ou Penicillium spp

  

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Geoquímica do Petróleo e Meio Ambiente, da Universidade Federal da Bahia, como requisito para a obtenção do título de Mestre em Geoquímica: Petróleo e Meio Ambiente.

Orientador: Prof. Dr. Ronaldo Montenegro Barbosa

Co-orientadora: Profª. Drª Cristina Maria Assis Lopes Tavares da Mata Hermida Quintella

Co-orientador: Prof. Dr. Jorge Alberto Trigüis

                                            

                                                                                       

SALVADOR

2013

"Dedico este trabalho às minhas filhas, Vastiane Evelise, Viviane Quênia, Cristiane Carla, Lilian Lucia, e aos meus netos, pelo apoio, carinho, amor e incentivo que me proporcionaram no decorrer desta caminha ao despertar das potencialidades. Dedico ainda ao meu esposo e companheiro, pelo seu amor e compreensão, sentimentos elevados e um clima de harmonia, os quais contribuíram para incentivar o meu desempenho nos estudos”.

AGRADECIMENTOS

Nesta oportunidade quero lembrar e agradecer a todos que contribuíram direta e indiretamente em todas as etapas da minha formação e agregaram valores para este estudo.

Agradeço a Deus pelo dom da vida, por mostrar e abrir meus caminhos na ciência, por me permitir alcançar esta etapa, sempre acreditando, com muita fé.

Às minhas filhas, netos e genros, pelo carinho e aconchego recebido, os quais sempre estiveram ao meu lado, dando incentivo, proporcionando horas de laser, bem-estar, união e compromisso para um melhor desempenho.

Ao meu esposo, Zenóbio, companheiro de todas as horas, pelo apoio recebido e por ter me dado amor e carinho nas horas de desafios.

Ao meu orientador, Dr. Ronaldo Montenegro Barbosa pela sua atenção dispensada ao discutirmos as etapas do trabalho, dentro da sua visão na prática de pesquisador.

A minha co-orientadora Dra. Cristina Quintella, uma verdadeira mestra e amiga, muito dinâmica, dotada de sabedoria e ciência, que acreditou no meu potencial em pesquisa. E por sua luta incessante pela divulgação e ampliação da Inovação, Ciência e Tecnologia, dando oportunidades valiosas no registro da transmissão de conhecimentos.

Ao meu co-orientador Dr. Jorge Alberto Trigüis, grande pesquisador em Geoquímica orgânica, por me permitir construir conhecimentos em sistemas petrolíferos.

Ao curso e professores do Pospetro, Pós-Graduação Geoquímica do Petróleo e Meio Ambiente/UFBA pela oportunidade e conhecimentos transmitidos, para este estudo.

Ao professor Ernande Melo de Oliveira, pela contribuição nas análises de Difratometria de Raios-X, GQ-UFBA, à Pérola por analise em Microscópio Eletrônico, contribuindo para o direcionamento à minha pesquisa com os novos produtos adquiridos, sucesso a todos.

À equipe do laboratório de Análises Clínicas e Toxicológicas FFAR-UFBA, à professora Drª Tânia Barros na realização das análises microbiológicas deste trabalho.

Ao Laboratório de Coordenação IQ-UFBA, ao Dr. Fábio Boro pelas análises de Espectroscopia de Infravermelho para o biopolímero e cristais protéicos.

Ao Laboratório do Dep. Análises Bromatológicas (UFBA), a Drª Mara Miranda pela realização das análises de Toxicologia em Aflatoxina.

A toda equipe LabLaser, a Arlete pelas análises em XRF, aos amigos e companheiros de pesquisa que contribuíram para o aprendizado que construímos juntos, um abraço.

A todos os companheiros, funcionários e técnicos do NEA, ao Laboratório de Campo, LEPETRO, a Sarah Adriana, pelo estudo em Cromatografia, meu carinho pela força.

À Petrobras e ao CNPQ pelo apoio financeiro e por acreditar no projeto.

Resumo

O presente trabalho avalia o processo e produto do uso de uma Mistura Microbiológica para a biorremediação de manguezais contaminados por petróleo, apresentando os melhores desempenhos com o bioestímulo torta de mamona e a bioaumentação fungo Aspergillus spp (flavus), comparados com o fertilizante NPK e fungo o Penicillium spp. A metodologia foi originalmente desenvolvida e patenteada para a biorremediação de sedimentos contaminados de petróleo da bacia sedimentar do Recôncavo Baiano. O mecanismo da biorremediação inicia-se com as proteínas vegetais armazenadas e com o processo de hidrólise da cisteína da ricina (uma metalo-protease), devido à síntese microbiana de transformar e retirar da mistura o oxigênio e nutrientes energéticos para sua proliferação pela geração de energia celular. A mistura é composta de glicerina bruta de mamona, torta de mamona, petróleo, areia calcinada, água salina e fungos e sua eficiência é comprovada por técnicas de XRF e cromatografia gasosa. São discutidos o procedimento e a validação da biorremediação através das técnicas de XRF, cromatografia gasosa e infravermelho. Os subprodutos da biorremediação são um biopolímero (identificado como FUNAMIDA) e um Cristal Proteico de Amida que são caracterizados quimicamente através das técnicas de XRF, cromatografia gasosa, infravermelho e difratometria de Raios-X. Esses sub-produtos podem ser vistos como novos materiais com potenciais empregos apontados para a indústria de implantes biomédicos, biossensores e eletrônica, uma vez que extrai elementos-chave como Ti e Ru. Dessa forma, sugere-se que a metodologia aqui descrita seja empregada para a área de biotecnologia, a qual irá direcionar o uso dos novos materiais sintetizados para suas devidas aplicações nos segmentos tecnológicos específicos.

Palavras-chave: Biorremediação. Bioestímulo. Bioaumentação. Biopolímero. Mamona. Fungo. Amida.

Abstract

The present study evaluates the process and product of a Microbial Mixture usage for bioremediation of petroleum contaminated wetlands, pointing the best performances for castor bean as biostimulation and fungus Aspergillus (flavus) as bioaugmentation, compared with NPK fertilizer and fungus Penicillium spp. The methodology was originally developed and patented for the bioremediation of oil contaminated sediments of the sedimentary basin of the Recôncavo. The mechanism of bioremediation begins with vegetable proteins stored and the process of hydrolysis of the cysteine of ricin (a metallo-protease), due to the microbial synthesis. The mixture is composed of crude glycerin castor oil, triturate castor oil, oil, sand, ash, salt water and fungi and their efficiency is proven by XRF techniques and gas chromatography. We discuss the procedure and the validation of bioremediation through the XRF techniques, gas chromatography and infrared. The byproducts of bioremediation are a biopolymer (labeled FUNAMIDA) and a Crystal Protein Amide which are chemically characterized by the techniques XRF, gas chromatography, IR and X-ray diffraction. These sub-products can be viewed as new materials with potential applications pointed to biomedical implants, biosensors and electronics industries, since it extracts key elements such as Ti and Ru. Thus, it is suggested that the methodology described here can be employed on biotechnology area, which will direct the use of new materials synthesized due to their technological applications in specific segments.

Keywords: Bioremediation. Biostimulation. Bioaugmentation. Biopolymer. Castor. Fungi. Amida.

1 INTRODUÇÃO

A biorremediação é uma técnica cientificamente comprovada e ecologicamente correta que propõe a utilização de plantas e microrganismos no tratamento de rejeitos potencialmente tóxicos para reduzir sua toxidade (ATLAS, 1995). Este processo, produzido pela ação de bactérias e fungos, é empregado pela descontaminação de ambientes impactados por petróleo. Rosa (2001) assevera que a biodegradação “[...] pode estar limitada à disponibilidade de nutrientes, composição e abundância das comunidades microbianas, salinidade, temperatura, concentração de oxigênio dissolvido e composição do óleo derramado” (ROSA, 2001, p. 2).

As contaminações com hidrocarbonetos do petróleo, por sua vez, são distúrbios que modificam o ambiente natural e sua capacidade de auto-renovação (QUINTELLA et al., 2009). Neste sentido, vê-se que o benefício maior da aplicação da biorremediação, é a mineralização, obtendo como produto final CO₂ e H₂O pela via aeróbica, assim como formação de biomassa, segundo Cunha (1996).

Para Uña e Garcia (1983), a transformação dos hidrocarbonetos pelos microrganismos pode ser facilitada pela produção de enzimas como catalisadores biológicos que controlam as reações bioquímicas, produzindo energia e material necessário para a proliferação de novas células microbianas. Os fungos produzem enzimas extracelulares oxidativas capazes de quebrar compostos de policíclicos aromáticos de cadeia longa e transformá-los em compostos assimiláveis ao seu metabolismo. Estas enzimas hidrolisam ligações peptídicas, quebrando-as, liberando peptídeos que são degradados a aminoácidos livres pelas peptidases (RODWELL, 2009). Importante salientar, que estudos indicam que ocorre o aumento da biodisponibilidade de policíclicos aromáticos (HPAs), aumento da taxa de solubilização dos metais pesados e aumento de solubilização de naftalenos pelo uso de biossurfactantes (NITSCHKE; PASTORE, 2002).

Um trabalho de biorremediacão se efetiva com processos de óxido-redução e atinge os principais aspectos relativos à degradação e à mineralização de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos. Tal processo acontece seguindo as etapas: Inicialmente, em fermentação, emitindo dispersão de gases (partículas menores). Em seguida, dá-se o efeito das emulsões, passando para a água as partículas solúveis com trocas iônicas e, finalmente, acontece, no substrato, as transformações físico-químicas produzidas pelos microrganismos para o seu metabolismo e assimilação.

1. 1    OBJETIVOS

1. 1. 1 Objetivo Geral

       O presente trabalho tem como objetivo avaliar o processo e os produtos do uso da Mistura Microbiológica para biorremediação de manguezais contaminados por petróleo, tendo a glicerina bruta e torta de mamona como bioestímulação e os fungos Aspergillus spp e Penicillium spp como bioaumentação.

1. 1. 2 Objetivos Específicos

Para tal objetivo geral acontecer, elegemos os seguintes objetivos específicos:

• definir a melhor metodologia/tecnologia para utilização de biorremediação em regiões de manguezal (artigo 1);

·         analisar a utilização dos subprodutos glicerina bruta e torta de mamona, e o fertilizante NPK (contendo nitrogênio fósforo e potássio), como bioestimulantes no processo de biorremediação pelos fungos no manguezal impactado com petróleo (artigo 2);

·         avaliar a contribuição dos derivados da mamona (glicerina bruta e torta de mamona) e do fertilizante NPK como bioestímulos dos fungos para o desenvolvimento e proliferação fúngica através de análises de cromatografia (artigo 2);

• avaliar os resultados dos compostos orgânicos (hidrocarbonetos totais, hidrocarbonetos saturados, aromáticos e biomarcadores) com a bioestimulação dos fungos Aspergillus spp e Penicillium spp, a fim de comprovar possível degradação de óleo no ambiente estudado;

Este trabalho justifica-se porque atende aos desafios da economia ao abrir portas para inovações orgânicas na ciência, gestão de negócios em biorremediação e desenvolvimento sustentável no plantio do campo e responsabilidade social com emprego e renda. Atende aos desafios tecnológicos ambientais, uma vez que a glicerina e torta de mamona, com o fungo anaeróbico facultativo, elaboram uma fermentação no sedimento argiloso do manguezal que favorece a aceleração da biorremediação natural.

1.      2  MICROORGANISMOS NA BIORREMEDIAÇÃO

A Agência de Proteção Ambiental estabelece como principais contaminantes do solo, em ordem crescente: cloroalifático, pesticidas, hidrocarbonetos aromáticos, cloroaromáticos, aromáticos simples e outros. Muitos têm sua origem na industrialização do petróleo bruto, outros nas indústrias químicas e atividades agrícolas. No âmbito da biorremediação, os mais visados são os hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (PAHs), os hidrocarbonetos halogenados, com os elementos Cloro, Bromo, são formadores de sal e ligações fortes com metais em geral iônicas. Estes são xenobióticos de grande persistência no solo, e os derivados nitrogenados do nitrotolueno (Agência de Proteção Ambiental dos EUA, combustíveis, EPA, petróleo, renováveis, Publicado em 10 de abril de 2012).

A microbiologia de degradação de hidrocarbonetos constitui um campo de pesquisa em pleno desenvolvimento. Tal interesse deve-se ao impacto que estes compostos podem causar no meio ambiente e à crescente utilização de procedimentos microbiológicos de descontaminação de solos, em razão de derramamento acidentais (BONAVENTURA; JOHNSON, 1997). O Enxofre contido nos compostos oleosos acelera os processos de biorremediação contribuindo para o metabolismo dos microorganismos (Apêndice A).

Fig: Biorremediação com fungos e transformações bioquímicas

Ramos (2005), por sua vez, aponta que composição química do resíduo também determina a velocidade da biodegradação de petróleo bruto. A fração de compostos saturados do petróleo degrada-se mais facilmente do que a insaturada, exercendo grande influência no tratamento dos resíduos de refinarias.

Faz-se necessário destacar, ainda, que para alcançar o objetivo da biorremediação, é preciso o conhecimento das condições que influenciam o processo, dentre elas: característica do resíduo, presença de condições microbiológicas ótimas, a seleção correta da tecnologia de biorremediação e o uso de métodos analíticos apropriados para determinar o tipo e a extensão da contaminação (HUESEMANN, 1994 apud PEDROTI, 2007).  

Dentre tantas formas de biorremediação, há as alternativas como a fitorremediação, que envolve o emprego de plantas para acelerar o processo de degradação. Estas contribuem através do efeito rizosférico sobre a microbiota biodegradadora (PRADHAN et al., 1998).

A biorremediação envolve o processo de bioaumentação, isto é, a inoculação do solo com culturas puras ou consórcio microbiano contendo microrganismos selecionados para degradações de contaminantes específicos. Esses processos têm sido bastante estudados para hidrocarbonetos clorados através do emprego de populações indígenas aclimatadas, isoladas e selecionadas (STRUTHERS et al., 1998; BEWEY, 1996 apud RAMOS, 2005).

Os surfactantes são moléculas que possuem uma extremidade hidrofílica (água) e a outra hidrofóbica (oleofílica), podendo ser sintéticos, se obtidos a partir de sínteses químicas, ou biossurfactantes, quando produzidos por microrganismos (CASSIDY; HUDAK, 2001; CETESB, 2003). Já se encontra bem documentado a capacidade do biossurfactante de emulsionar misturas de hidrocarboneto e água. Tal propriedade envolve o aumento significativo de degradação dos hidrocarbonetos e, por isso, é utilizado na biorremediação de solos impactados e mananciais contaminados (LOBATO, 2000; CRAPEZ et al., 2002).

O crescimento de microrganismos em uma interface de água e óleo favorece o aparecimento de um biofilme, no qual os microrganismos se aderem à superfície de grandes gotas de óleo devido à hidrofobicidade das células, passando a formar uma delgada interface, extraindo os compostos insolúveis em água da fase oleosa e utilizando os sais minerais da fase aquosa. À medida que as células revestem as gotas de óleo produzindo biossurfactantes, reduz-se a tensão interfacial, o que favorece o crescimento e a colonização microbiana (ASCON-CABRERA; LEBEAULT, 1995 apud MARTINS, 2005).

Quanto à mamona, Ricinus communis, é uma fonte de energia para os microrganismos heterotróficos, modifica a atividade enzimática, além de favorecer a soimbilização de compostos minerais e inibir o efeito de algumas toxinas (TERRON, 1995 apud CAVALCANTI, 1998). A ricina é uma proteína inativadora de ribossomos (RIPs) do tipo II, heterodimérica, com a enzima inibidora de ribossomo (~32 KDa, cadeia A ou RTA) ligada por ponte dissulfeto a uma lectina galactose (~34KDa, cadeia B ou RTB). Já a cisteína é um aminoácido sulfurado, fonte de sulfato inorgânico, uma metalo-protease que usa um íon metal no seu mecanismo catalítico e hidrolisa as proteínas em aminoácidos, facilitando a sua absorção pelas células, uma vez que possui um papel despolimerizante (ALVAREZ-SANCHEZ et al., 2000). 

            Dessa forma, a torta de mamona contém um elevado conteúdo protéico que a torna uma boa matéria-prima para a produção dos seguintes aminoácidos: arginina (11,0%), cistina (3,5%), fenilalanina (4,2%), histerina (11,0%), isoleucina (5,3%), leucina (7,3%), lisina (3,1%), metiolina (1,5%), tirosina (1,0%), treonina (3,6%), triptofano (0,6%) e valina (6,6%) (BELTRÃO, 2003).

Importante destacar que a distribuição de plantio da mamona para produção industrial em grandes áreas torna o meio ambiente verdejante, além de a fotossíntese contribuir para a mitigação da mudança climática global. Com o uso desse produto natural, biodegradável, inserido na indústria petrolífera com potencial energético e com disponibilidade em todo o Brasil, dá-se o exemplo de biotecnologia e auto-suficiência num país tropical.

1. 2. 1 Processos de biodegradação do petróleo por bactérias e fungos

Sabe-se que fungos e bactérias são os principais microrganismos degradadores de hidrocarbonetos. Neste ínterim, Oliveira (2007) apresenta o emprego de esporos de Bacillus subtilis LAMI007 não patogênicos não modificados geneticamente, aprisionados em microesferas de quitosana para operações de biofertilização e biodegradação como biossurfactantes. Neste trabalho, propõe-se o emprego de esporos bacterianos, os quais ao serem empregados germinam, tornando-se ativos como biofertilizantes, biodegradadores e biorremediadores em ambientes naturais, domésticos e industriais. 

Já Guiot e Tartakovsky (2007) apresentam um método para biorremediação de águas residuais, especialmente águas subterrâneas, por meio do emprego de tratamento biológico aeróbico e anaeróbico acoplado. Mais especificamente, o método contempla o uso de populações microbianas metanogênicas (estritamente anaeróbicas) e metanotróficas (estritamente aeróbicas) em combinação com um suprimento de oxigênio e hidrogênio dissolvidos em água in situ. A eletrólise da água é usada para produzir oxigênio e hidrogênio dissolvidos em água. A vantagem imediata do uso de H₂O originária da eletrólise é o fornecimento de doadores de elétrons para metanógenos, objetivando desclorar redutivamente a cloroalifatia e reduzir os carbonatos na água, além de gerar metano, o qual é usado como fonte de energia e carbono para as bactérias metanotróficas. O oxigênio é usado como aceptor de elétrons pelas bactérias aeróbicas, incluindo as metanotróficas.

Leite et al., (2005), por sua vez, apresentam um biorreator horizontal para processos ex-situ de biorremediação de solos argilosos contaminados com hidrocarbonetos e um processo de biorremediação de solos argilosos efetuado com auxílio do mesmo.

Já Fávero (2005), expõe uma técnica de adição de composto para bioaumentação, biorremediação, bioproteção e bionibição. O produto é composto por bactérias e fungos que atuam de maneira a minimizar a produção de gases fétidos, acelerarem o processo de degradação de matéria orgânica e inibir o desenvolvimento de patogênicos e fitopatógenos por mecanismos de inibição, competição, exclusão competitiva, ou seja, disputa por substratos entre microrganismos benéficos, patogênicos e fitopatógenos.

1. 2. 2 Biorremediação por fungos

Retornando aos fungos, verifica-se que constituem um vasto grupo de organismos classificados como um reino denominado Fungi, pertencente ao domínio Eukaryota. Esse reino, de mais de um milhão e meio de espécies, algumas delas microscópicas, é ainda quase desconhecido para a ciência e contribui de forma decisiva para a preservação da diversidade biológica do nosso planeta. Os fungos estão presentes de diversas formas no cotidiano. Possuem um corpo vegetativo chamado talo ou soma que é composto de finos filamentos unicelulares chamados hifas. Estas, geralmente, formam uma rede microscópica junto ao substrato (fonte de alimento), chamada micélio, por onde o alimento é absorvido. Os micélios podem ser cenocílico ou septado. A célula fúngica é uma estrutura similar a células animais, porém, com parede celular distinta (CLÉCIO, 2008).

Entre os microrganismos que podem ser utilizados para o tratamento biológico de derrames de petróleo, os fungos vêm se mostrando hábeis em degradar compostos xenobióticos e outros de grandes cadeias moleculares que, em geral, são de difícil degradação. Além do mais, os fungos sobrevivem e crescem em meios com concentração elevada de compostos recalcitrantes e são capazes de utilizá-los como fonte de energia (EGGEN; MAJCHERCZYK, 1998; ESPOSITO; AZEVEDO, 2004; OLIVEIRA et al., 2006; SANTOS; LINARDI, 2004 apud SANTAELLA et al., 2009).

Os fungos filamentosos são os mais eficientes na produção de enzimas extracelulares oxidativas, dentre elas proteases, celulases, ligninases e outras (EGGEN; MAJCHERCZYK, 1998 apud SANTAELLA et al., 2009). Pelo processo das enzimas proteases, as partículas metálicas que as compõem se expõe em maior quantidade no meio aquoso salino, possibilitando um aumento de frações nanométricas que, ao se reagruparem, formam uma interação provocando a mineralização do substrato.  Podem adaptar-se, ainda, às mais variadas concentrações de oxigênio, podendo utilizar tanto o oxigênio livre como o oxigênio combinado. Dependendo da concentração deste elemento no meio em que se encontram, utiliza-se de rotas metabólicas alternativas (desnitrificação e amonificação), além da respiração aeróbica convencional (TAKAYA, 2002). Os fungos podem apresentar-se como organismos unicelulares livres (leveduras), formar aglomerados (pseudomicélio) ou filamentos (micélio). A reprodução pode ser assexuada ou sexuada. Quanto aos nutrientes requeridos são os elementos C, O, H, N, P, K, Mg, S,  B, Mn, Cu, Mo, Fe, Zn, além da luminosidade, a temperatura, a acidez e a umidade.

No que se refere ao fungo Aspergillus fumigatus, sabe-se que uma cepa foi isolada durante um programa de seleção de microrganismo do solo para que se realizasse uma caracterização inicial de suas enzimas extracelulares (PERALTA; DOMINGUES, 1993).  Pode estar presente em diversos meios, é facultativamente anaeróbico, ou seja, pode atuar com ou sem presença do gás oxigênio, e resiste a uma ampla faixa de temperatura.  Além do mais, este fungo tem sido apontado com potencial de degradação dos hidrocarbonetos de petróleo com a atividade da produção microbiana (RAPER; FENNELL, 1999). Mariano (2006) assegura, também, que para algumas aplicações, a bioestimulação de microrganismos autóctones é a melhor escolha, considerando o custo e desempenho. É conhecido ainda que as proteínas surfactantes possam interagir com os antígenos glicosilados de Aspergillus spp, fungos filamentosos.

O Penicillium spp, por seu turno, é um gênero de fungos conhecido como o comum bolor do pão que cresce em matéria orgânica morta. Várias espécies produzem bactericidas (antibióticos) que permitem ao fungo lutar contra a competição feroz das bactérias saprófitas pelo alimento. Pitt (1985) e Cerniglia (1997) apontam a capacidade de degradação de hidrocarbonetos por estes fungos, uma vez que metabolizam os HAPs que possuem de dois a seis anéis aromáticos.

Fig. Biorremediação por fungos

1. 2. 3 Bioestímulo fertilizante NPK e o vegetal Ricinus communis.

         ₄)₃PO₄, sulfato de amônia (NH₄)₂SO₄, cloreto de potássio (KCl) e farelo de algodão. Estes serão comparados com o vegetal Ricinus communis nas variáveis de bioestímulo para ambos os fungos.

   Já o fertilizante NPK10-10-10 contém os principais macros nutrientes: nitrogênio, fósforo e potássio. Este é um fertilizante solúvel em água, formado na sua composição por fósforo monoamônico (NH

 Souza (2003) apontou que a biorremediação com a utilização de NPK, na proporção de 10% p/v do volume de óleo derramado, contribuiu para retirada de aproximadamente 30% dos alcanos; enquanto que a evaporação natural retirou aproximadamente 60% dos n-alcanos menores que n-C16 nos quatro primeiros dias da simulação, chegando a 80% após um mês.

Rosa (2001), em testes laboratoriais, também demonstrou boa eficiência do NPK como agente bioestimulador com relação a alguns dos seus componentes na limpeza de derrames de óleo. As ações decompositoras dos fungos removem resíduos terminais que são substituídos, ciclizados ou ligados por ligações isopeptídicas.

Com o intuito de reduzir o impacto ambiental causado com o descarte de efluentes contaminados com metais pesados, métodos alternativos, de baixo custo e eficientes têm sido desenvolvidos. Um deles é um processo químico de remediação em que ocorrem trocas iônicas entre duas ou mais fases cuja transferência de íons depende da eletroneutralidade regulada pela concentração dos íons nas fases (DAL BOSCO; JIMENEZ; CARVALHO, 2004). Neste processo, faz-se necessário uma investigação sobre a interação sedimento/rocha/fluido nos mega processos provocados pelos microrganismos (Figura 01) que ocorrem na superfície do grão, estimulados na presença de traços de metais.

A oxidação química é empregada para decompor, reduzir ou eliminar a toxidade dos contaminantes presentes, já que as reações de oxidação podem ocorrer naturalmente e são aceleradas mediante agentes oxidantes como O₃, H₂O₂ e persulfatos (CETESB, 2010).  A redução química in situ envolve processos físico-químico-biológicos em sinergia criando condições redutivas extremas Eh (Potencial Redox) baixos, conforme Pujol (2009).

A mistura, composta alternadamente com torta de mamona e fertilizante NPK10-10-10, os fungos Aspergillus spp e Penicillium spp, é utilizada para produzir surfactante, pois contém glicerina bruta, ácidos, ésteres, álcalis e álcoois, óleo, glicerídeos, água e sais variados.

Para a obtenção do processo de biorremediação pela ação de bactérias e fungos de áreas impactadas por petróleo serão observados e analisados os parâmetros:

- Fatores físico-químicos.                 - Fatores biológicos

- Biorremediação por microorganismos

                        - Bioestimulação – populações autóctones.

                        - Bioaumentação – introdução de microorganismos

- Monitoramento -               

              - Avaliação em método

                        - Baseado em isolamento e cultivo e Independente de cultivo.

            Figura 01: Amostra de coleta de campo em manguezal com derrame de petróleo 

          

2        MATERIAIS E MÉTODOS

2. 1 O EXPERIMENTO E O SÍTIO DE ESTUDO.

Esta pesquisa foi desenvolvida no campo prático/experimental e teórico da Geoquímica Ambiental cujos estudos “preocupam-se, especialmente, com a qualidade de vida do homem e o equilíbrio antropocêntrico” (CARVALHO, 1989, p. 19), atentando para processos químicos e fontes atuais de desequilíbrio da natureza.

            Realizou-se na unidade do laboratório de campo, nas proximidades do estuário do rio São Paulo. Esta unidade laboratorial, que se constitui como extensão do Laboratório de Estudos do Petróleo (LEPETRO), foi denominada “Laboratório de Simulação de Processos de Biorremediação” (LEPETRO - SIMULAÇÃO), e está localizado no município de Candeias, porção NW da Baia de Todos os Santos (Figura 02).

Figura 02 – Mapa da Área de Estudo e Foto Localização. a) Mapa de Situação e Localização da Baía de Todos os Santos. b) Fotografia da área de coleta de sedimento.

 

Fonte: Adaptado de Bahia (2004).

            Além dessa unidade, trabalhou-se no Núcleo de Estudos Ambientais (NEA) do Instituto de Geociências (IGEO/UFBA) em conjunto com o LabLaser - Laboratório de Cinética e Dinâmica Molecular do Instituto de Química (IQ/UFBA), os quais possuem infra-estrutura adequada para a execução do projeto, como suporte na aplicação experimental científica.

            Mais precisamente destaca-se (Figura 03) a área estudada, que está situada entre os municípios de Madre de Deus, Candeias e São Francisco do Conde, é representativa do Bioma Mata Atlântica, no ecossistema manguezal. No entanto, está exposta à possibilidade de acidentes oriundos da atividade petrolífera, encontra-se nas proximidades de zona de produção, refino e transporte da Refinaria Landulfo Alves – Mataripe (RLAM).

Figura 03 – Área de estudo e foto de mapa de localização

             

2.      2 BIORREMEDIAÇÃO, BIOESTIMULAÇÃO, BIOAUMENTAÇÃO

Em unidade de simulação, como inovação em biorremediação de manguezais contaminados com petróleo exsudado, foram utilizados, subprodutos da primeira geração de biocombustíveis, glicerina e torta de mamona como bioestímulo, sub a ação dos agentes de bioaumentação fungos Aspergillus spp, com predominância dos Aspergillus flavus e dos fungos Penicillium spp. Mais especificamente utilizou-se um consórcio com mamona e NPK, associados aos agentes, fungos no processo microbiológico, acelerado pela proteína vegetal inibidora ricina da mamona na fermentação alcoólica.

Inicialmente foi analisada a granulometria com centrifugação do sedimento manguezal coletado em campo contaminado e utilizado no experimental em aquários de campo.

A)    Semeadura

Fig. Semeadura de Mistura Microbiológica com Fungos em Placas de Petri.

A confiabilidade no processo de validação de biorremediação foi reproduzida e verificaram-se nos dados reportados no Capítulo 4, garantindo sua comprovação. Foram separados os produtos e quantificados com adaptação equivalente à Patente de Invenção UFBA (QUINTELLA, GONÇALVES, 2010) nas proporções, encontra-se no Apêndice B. Houve também a comparação em outras unidades utilizando-se como padrão comercialmente disponível NPK fertilizante (Apêndice C).

No Apêndice D estão detalhadas a coleta do sedimento manguezal e a extração das alíquotas de hidrocarbonetos para análise de cromatografia líquida e gasosa. Foi utilizado liofilizador, macerado, peneirado para uso no extrator sofxlet. As semeaduras descritas e caracterizadas, tiveram seus produtos analisados com o acompanhamento das unidades de simulação, durante o período de 8 semanas, e seus parâmetros físico-químicos dos bioestímulos não conservativos como indicado no Apêndice E. Os parâmetros pH, salinidade, temperatura, oxigênio dissolvido foram mensurados com auxílio dos seguintes equipamentos:

- Refratômetro Hand Refractometer ATAGO modelo S/Mill-E;

- Condutivímetro Handylab 1, com precisão de 0,05μS.cm-1;

- pH-metro Handylab LF1, com precisão de 0,01 unidade de pH e/ou mVe;

- Oxímetro WTW OXI 3151, marca SCHOTT-GERATE, precisão de 0,01mg.L-1

            Os parâmetros foram monitorados semanalmente no que apontam o comportamento do pH e Eh e influências químicas. Foi elaborada uma tabela com os dados dos parâmetros físicos observados durante todo o período da biorremediação; elaborou-se gráficos para maior compreensão do pH e do Eh da biorremediação; da salinidade e EH Mv, acompanhando assim também o comportamento gráfico da  salinidade e condutividade.

Durante o período do experimento, o sedimento mostrou-se com cores estriadas, este fato levou a se fazer análise de toxicidade para Aflatoxina a fim de eliminar suspeitas de produção tóxica ao ambiente. Após análise, obteve-se resultado negativo, o que se demonstra visualmente é que são as etapas de transformações físico-químicas pelas quais passam as amostras durante o período de biorremediação. Atento ainda quanto às transformações, visualmente, pode-se observar larvas, pequenos Nematódeos, na biorremediação e até pequenos insetos voadores, o que caracteriza a matéria orgânica em abundância e existência de vida.

Inicialmente foram caracterizados os referenciais, branco que compõe a mistura microbiológica em cromatografia com extração dos hidrocarbonetos, alíquotas dos saturados, aromáticos e NOS, e feito Gráfico Ternário com o percentual encontrado.

Para obter a determinação de nitrogênio total foi utilizado o método volumétrico Micro-Kjeldahl, segundo os procedimentos descritos em BREMNER (1965). Utilizou-se de 0,7 g de amostra sedimento manguezal; 1,0 g de digestora (solução mistura); 3 mL de ácido sulfúrico (H₂ S0₄ (C). Estes foram colocados em tubo Kjeldahl homogeneizado na capela e adicionado o ácido sulfúrico. Logo após, colocou-os no bloco digestor à 350º C por 4 h (50-50º). Em seguida, a amostra foi colocada no extrator,  digerida  e deixada para esfriar na capela. Para melhor amostragem, foram feitas três amostras e tirada à média para se obter a quantidade da concentração para ser usada posteriormente nos bioestíamulos NPK e torta de mamona. Houve também procedimento para a análise de fósforo no sedimento.

Para os inorgânicos foram feitas pastilhas com as amostras e analisadas em Fluorescência de Raios-X (XRF). Foram amostras do óleo total de todas as simulações nas 8 semanas, e nas alíquotas dos saturados dos Aspergillus spp este demonstrativo encontra-se no Apêndice F. Obtendo-se assim para cada semana 4 amostras, duas de bioaumentação com fungos e duas de bioestimulação com os nutrientes num total de 32 amostras.

Para a investigação orgânica dos hidrocarbonetos nas 8 semanas foram feitas as análises de cromatografia líquida e gasosa das amostras de Aspergillus spp com mamona, das alíquotas de saturados e aromáticos (Apêndice G). Também foram acompanhadas as prováveis alterações sofridas por compostos aromáticos alquilados (ROQUES; OVERTON; HENCY, 1994), utilizando o Cromatográfico a Gás (CG) Factor Four Variam 3900. Estes procedimentos fornecerão os perfis denominados fingerprints, que indicarão quais os compostos do óleo presentes e suas alterações à medida que os microrganismos degradem o contaminante.

Após as análises foram obtidos os resultados dos cromatogramas dos fungos Aspergillus e mamona e dos Aspergillus e NPK e analisadas as comparações e normalização dos bioestímulos e bioaumento, através de gráficos. Foi analisada também a comparação entre a biorremediação de fungos e de bactéria, comparação de cromatogramas de biorremediação de fungo Aspergillus com mamona 7 dias, e 60 dias e bactéria 60 dias. Ainda para uma melhor avaliação foi investigada a normalização da área total com Aspergillus e mamona; Normalização da área total com Aspergillus e NPK. Foi avaliada a degradação dos hidrocarbonetos cíclicos, fitano e pristano. Outra avaliação foi feita com o calculo da quantidade de HTP/Kg, com bioestimulação mamona, NPK e bioaumentação com fungos, o mesmo procedimento com fungos com mamona e NPK, na análise da quantidade de MCNR/Kg. Com os dados analíticos obtidos em cromatografia e XRF foi feita Análise Estatística de Componentes Variados, os quais indicam as transformações bioquímicas sofridas durante o processo de biorremediação no Gráfico de loadings com XRF.